因?yàn)閷?duì)孔徑的共同的安置,共聚集顯微鏡勘探器所供給的圖畫對(duì)應(yīng)于一個(gè)薄的光學(xué)切片或是樣品的截面。例如,一個(gè)幾毫米厚的樣品在焦平面處沿z軸降最少于微米。
共聚集處的光照?qǐng)鐾ㄟ^(guò)一個(gè)被稱為針孔的孔徑所約束。視場(chǎng)相同也遭到一個(gè)針孔的約束,針孔的方位是相關(guān)于第一個(gè)孔徑與照耀點(diǎn)共軛的像平面上。這種共聚集裝備的成果即是降低了對(duì)散焦光的勘探,然后通過(guò)削減成像容積來(lái)添加信噪比。
Marvin Minsky首要規(guī)劃了共聚集顯微鏡并在1957年的一份專利中描繪了一個(gè)通過(guò)移動(dòng)照耀光束渠道來(lái)完成的。從樣品發(fā)來(lái)的調(diào)制光被送往光電管用示波器調(diào)查。光照耀及隨后的勘探是通逐點(diǎn)地過(guò)移動(dòng)渠道來(lái)完成的。Minsky的極具自創(chuàng)性的設(shè)想終究徹底改變了顯微鏡。
Minsky的專利被通過(guò)的時(shí)分,仍是存在有幾個(gè)技能難點(diǎn)。因?yàn)榧s束孔徑,他的體系需求非常強(qiáng)的光源。鑒于由針孔損失的光強(qiáng),在其時(shí)激光并不存在,而且也沒(méi)有別的滿足強(qiáng)的光源來(lái)激起熒光。在那時(shí)分Minsky運(yùn)用的是長(zhǎng)期耐久的示波器做觀測(cè),因而沒(méi)有辦法照實(shí)記載圖畫。致使別的發(fā)明者對(duì)這一特別的顯微鏡做進(jìn)一步的發(fā)展變成對(duì)一般研究者的有用東西。
發(fā)展激烈的單色光源—激光—處理了照耀的疑問(wèn)。計(jì)算機(jī)裝備了數(shù)字化儀以后,使記載和實(shí)踐圖畫變得垂手可得。如今,如今掃描共焦運(yùn)用激光或結(jié)合激光作為照耀光源。這種掃描是通過(guò)精確操控振鏡以光柵運(yùn)動(dòng)的方法,用最小光斑掃過(guò)視場(chǎng),就像通過(guò)電腦操控電視相同。從樣品散射或反射的熒光信號(hào)被發(fā)送到光電倍增管(PMT),這是一次構(gòu)成圖畫在屏幕上的一個(gè)點(diǎn)(像元素、像素點(diǎn))。
盡管Minsky羅列了共聚集的很多長(zhǎng)處,或許最主要的功用即是掃描共聚集顯微鏡能夠?qū)悠愤M(jìn)行光學(xué)截面成像。傳統(tǒng)上,通過(guò)固定安排然后細(xì)心地將其切片成以便調(diào)查和成像的薄層,來(lái)獲取細(xì)胞或安排的精細(xì)結(jié)構(gòu)。這個(gè)進(jìn)程需求將樣品處死,而且需求研究人員花費(fèi)好幾年時(shí)刻去學(xué)習(xí)切片技能才能將樣品切割到成像所需的滿足薄的厚度。
共聚集的光學(xué)切片功能答應(yīng)用戶對(duì)厚安排成像而不需求特別的切片竅門。它還答應(yīng)用戶對(duì)活的細(xì)胞、安排以及生物體進(jìn)行超高分辨率成像?;铙w細(xì)胞成像現(xiàn)已變成共焦顯微鏡的一個(gè)主要組成部分。
這種光學(xué)切片的才能也意味著單張切片/圖畫能夠保存到計(jì)算機(jī),然后還能夠?qū)D畫重組為樣品的三維圖畫。這在現(xiàn)有的激光掃描體系中是非常主要的特征。
此體系在熒光成像中會(huì)選用一些特別的光學(xué)元件。一個(gè)多見(jiàn)的誤解以為激光器發(fā)生的激光輸出只有一個(gè)波長(zhǎng)。實(shí)踐上簡(jiǎn)直一切的激光器都將發(fā)生諧波或散射別的波長(zhǎng)光。盡管這些次波段的光跟主波段比較強(qiáng)度很弱,但是他們?nèi)允悄軌虼蟠蠼档托旁氡取<偃鐭晒獾陌l(fā)射波段恰好落在激光諧波的規(guī)模內(nèi)(或是來(lái)自激光的別的雜光),那么熒光信號(hào)可能會(huì)徹底被掩蓋掉而勘探不到。
光路中的首要器件即是激光純化濾波片,這即是經(jīng)修飾過(guò)的激起光濾波片。因?yàn)榧す獾南喔尚院拖鄬?duì)較小的光束以及光路準(zhǔn)直的請(qǐng)求,這些鏡片都是要通過(guò)研磨和拋光處理的。這就與寬場(chǎng)顯微鏡構(gòu)成明顯的對(duì)比,因?yàn)閷拡?chǎng)顯微鏡不需求研磨和拋光。純化鏡片還應(yīng)具有極好的傳輸特性,包括波前畸變要少于每英寸一個(gè)波長(zhǎng)。違背角(與鏡片外緣理想平行線的偏差)應(yīng)盡量減小到小于一個(gè)弧度角分,這么在同一個(gè)體系中運(yùn)用不一樣純化濾波片的時(shí)分就不用從頭糾正了。
一個(gè)純化濾波片的半波寬度(FWHM)通常是在10nm左右。它會(huì)堵塞激光光源的別的雜光(最大規(guī)模會(huì)從紫外光到1200nm)和減反射涂層來(lái)到達(dá)最大傳輸。
跟著更新、更強(qiáng)的激光器的呈現(xiàn),運(yùn)用增透膜來(lái)添加透過(guò)率就顯得沒(méi)有必要了。但是,這些光學(xué)器件選用最大反射的干涉涂層以防止熱損害,增透膜將因而削減表面反射。這些反射光不能被反射進(jìn)入激光器的共振腔。因而,這些光件被規(guī)劃用于入射角(AOI)在3.5度到5度之間。二極管激光器在熱身以后所發(fā)射的光的波長(zhǎng)會(huì)有輕微的變化,因而,我們主張為這些光源裝備20-25nm寬的純化濾波片。在共聚集體系和一般熒光顯微體系中,為了獲得較好的平面平整度,它們有必要克服波前像差。盡管兩種體系的波前像差都操控在每英寸一個(gè)波的規(guī)模內(nèi),但在共聚集體系中挑選二向色鏡明顯能夠獲得更好的作用。
現(xiàn)在,要4-6m厚的熔融石英基片上完成二向色性現(xiàn)已很多見(jiàn)了,但不斷增加的需求需求用更厚的基片來(lái)消除波前像差并完成二向色性。
在過(guò)去幾年時(shí)刻里,跟著激光器的規(guī)模做得越來(lái)越大,也會(huì)有這些越來(lái)越大的功率負(fù)載可能會(huì)摧毀主鏡方面的擔(dān)心。這關(guān)于規(guī)劃杰出的二向色鏡來(lái)說(shuō)不成疑問(wèn),對(duì)多見(jiàn)大小的光束負(fù)載最少到達(dá)8-10瓦特的功率。通過(guò)增透膜來(lái)最大極限的減小聚束光的反射使透射率最大化。
偏振也是濾鏡要思考的另一個(gè)因素。因?yàn)橐磺械墓饧?duì)光路有偏轉(zhuǎn)視點(diǎn)時(shí)都能夠充任偏振鏡,這對(duì)大多數(shù)偏振激光來(lái)說(shuō)就顯得尤為主要。
一切熒光發(fā)射濾鏡的主要作用即是阻撓激起光的透過(guò)。比較較于熒光顯微鏡而言,關(guān)于共聚集體系,這種堵塞并不包括很寬的光譜規(guī)模。但是,因?yàn)榧す馐母吖β瘦敵?,需求?duì)激光發(fā)射的特定波長(zhǎng)專門規(guī)劃更大的堵塞(或許高于OD 8)。
對(duì)共聚集體系發(fā)射濾鏡的實(shí)踐規(guī)劃仍是存在一些爭(zhēng)議。因?yàn)榇蠖鄶?shù)勘探器選用光電倍增管(PMT),圖畫一次采集只構(gòu)成一個(gè)像素(圖畫元素),這些濾鏡光件就不需求打磨和拋光。但因?yàn)楣簿奂上駥?duì)分辨率的請(qǐng)求越來(lái)越高,就像別的發(fā)射濾波片相同通過(guò)打磨和拋光并不是在糟蹋精力。近期一些依據(jù)標(biāo)明,發(fā)射濾波片具有較大楔形時(shí)(光束變差)可能會(huì)形成形態(tài)學(xué)丈量的不精確,這種不精確在長(zhǎng)發(fā)射光路中可能會(huì)更嚴(yán)峻。
激光體系的濾波片光具座是環(huán)繞激光發(fā)射而規(guī)劃的,并不一定對(duì)于特定熒光染料的最大或激起。這的確帶來(lái)有關(guān)的幾個(gè)疑問(wèn),什么樣的熒光染料才合適特定的激光體系。走運(yùn)的是,如今從熒光染料的供應(yīng)商那里能夠獲得更多的挑選了。別的也能夠挑選運(yùn)用能夠便利和快速反射多個(gè)激光束的多色主鏡。